VEGFR抑制剂对HUVEC细胞信号通路的抑制作用
具体实验步骤如下:
1)将处于对数生长期的 HUVEC细胞按 5×105cell/2ml/孔接种于 6 孔板中。
2)待细胞长至半满后,将培养基换为0.1%BSA 的 M199培养基,饥饿细胞 8 h。
3)加入不同浓度的待筛化合物和阳性对照化合物作用90 min。
4)加入50 ng/ml 的 VEGF 刺激10 min。
5)收集细胞,先用冷的PBS(含
6)细胞裂解物在沸水浴中加热10 min后,于
7)取上清液进行SDS-PAGE电泳。
8)转膜,电泳结束后,用半干电转移系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL,USA)。
9)封闭,将硝酸纤维素膜置于封闭液(5%脱脂奶粉稀释于含1 mM钒酸钠的TBS)中室温封闭2 h。
10)一抗,然后将膜分别置于抗VEGFR信号通路相关抗体p-VEGFR2抗体、p-Erk 抗体和 Actin 抗体溶液中
11)用含1 mM钒酸钠的 TBS 洗涤3次,每次15 min。将膜置于二抗溶液中室温反应1-2 h,同上洗膜三次后,用ECL试剂发色,压片,显影。